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8ppav_www.8ppav.com科选择何种方法开展抗核抗体检测的一点儿建议

日期:2019-06-30 13:45:59 来源:中华8ppav_www.8ppav.com医学网 作者:赵晋文  魏殿军 点击:

赵晋文  魏殿军

单位:河北燕达医院

 

我国许多医院特别是二级和部分三级医院尚未开展抗核抗体(ANA)的8ppav_www.8ppav.com。因标本少和其他一些技术原因,标本大多外送。但随着医院发展,患者需求,以及标本周期等问题,需要开展ANA的检测。本文推荐相关想开展该检查的单位阅读,以平衡、了解有关检测的选择。

ANA测试的最佳方法是什么?或者,如果您的实验室开展ANA8ppav_www.8ppav.com多年,但是阅读ANA间接免疫荧光(IIF)幻灯片30年的技术专家刚刚宣布她将退休。这时候可能关心的就是我们还继续做吗?是否要更换方法?当前的选择还有什么?等等问题。本文参考国外一些专家的意见,给出一些建议。也希望通过本文能拓展视野,了解业态,让这一工作有据可依。

当然,这些都是重要的问题,但没有简单的答案。本文旨在提供关于ANA8ppav_www.8ppav.com方法选择的实用信息,包括它们的诊断实用性和性能特征。

ANA检测是一种针对多种多样的细胞核和细胞浆抗原的自身抗体的集合。首次描述ANA在50多年前,至今仍是评估疑似结缔组织疾病(CTDs)患者最敏感的血清学指标,结缔组织病(CTD)也被称为ANA相关性风湿病(AARDs)。

ANAs的诊断起源于狼疮细胞(LE细胞)的发现,这种细胞被描述为含有吞噬细胞核物质的成熟多形核白细胞。之所以这样命名是因为它们只在系统性红斑狼疮(SLE)患者中发现。

通过提取患者血浆,并将其与经处理的健康对照者的外周血混合,可以在体外产生LE细胞。健康对照者的外周血因与玻璃珠发生涡流而“受损”。

最终,研究表明,患者血浆中的免疫球蛋白与“受损”外周血的细胞核结合,而这些细胞核又被中性粒细胞吞噬。IIF被用来进一步表征这种免疫球蛋白,证明其与细胞核物质行特异度结合。这个免疫球蛋白就是我们现在所知道的ANA。

ANA检测一般分为两步骤。

☑ 首先,对于疑似AARD的患者,无论抗原特异度如何,均先进行ANA筛查以确定ANA。

☑ 其次,对于筛查试验结果为阳性的患者,要增加额外试验确定ANA的特异度抗原。

识别抗原特异度对患者的诊断和预后具有重要意义。虽然可能有超过几十种甚至上百种抗原与ANAs有关,但通常只有一小部分可用于常规临床检测。

根据患者的具体临床情况,对ANA阳性可能需要抗双链DNA抗体、针对一种或多种可提取的核抗原成分(SS-A、SS-B、Sm、Scl-70、jo1和RNP等)的抗体、抗核糖体P抗体或抗着丝粒抗体的检测。


 一、如何选择检测方法 

临床实验室筛查ANA的主要方法有三种:IIF酶免疫分析法(EIA)多重免疫分析法(MIA)。

IIF检测与组织底物结合的抗体。ANA检测的底物通常是固定的HEp-2细胞。IIF使用荧光标记的抗人类免疫球蛋白来完成这项检测。

 

在EIA中,粘附在固体表面(通常是96孔板)的抗原混合物取代HEp-2细胞,并通过酶标记的抗人类免疫球蛋白进行检测。

 

MIAs是基于聚苯乙烯珠集,用以区别于标记基于抗原的荧光特征。每个小珠都与已知的ANA抗原结合连接,并将不同的珠做成集合。将患者样本置于集合中,通过荧光标记的抗人类免疫球蛋白将患者抗体与所选的珠集结合,并报告ANA测试结果。

从医生的角度来看,ANA筛查方法之间最明显的区别之一是如何报告结果。

在大多数情况下,MIA定性报告为“ANA阳性”或“ANA阴性”,筛查结果基于对试验中包含的所有单个抗原特异度集合的评估。

如果所有包含的抗原特异度均为阴性,则ANA筛查被解释为阴性。相反,如果一个或多个珠子显示出超过一定阈值的荧光,样本就会被确定为阳性。

参考国外的情况为,若采用MIA法,对于ANA阳性样本,实验室不会报具体的特异度抗体,如果临床医生想要确定患者ANA的抗原特异度,则需要申请特异度抗体试验。

相反,大多数EIAs报告则报告测量数值。由于这些检测没有可溯源的标准,因此每个制造商都会建立自己的测定单位及分析范围。

EIAs的定量是以吸光度为基础的,采用吸光度与标准曲线进行比较计算获得。一般制造商会提供一个推荐的cut off值,高于这个值被认为是“ANA阳性”。

与MIAs一样,阳性的EIA结果不能显示ANA的抗原特异度,如果临床医生想知道这些细节,还需要申请进一步测试。

IIF报告的ANA通常同时既有滴度也有抗核抗体模式。

实验室首先以1:40或1:80的稀释倍数对所有样本进行筛选。任何在筛选稀释中被确定为阳性的样本,要根据实验室的惯例,要么被稀释到终点,要么被稀释到预先确定的稀释度。

滴度则通过连续稀释并报告最终确定为阳性的滴度结果。荧光模式解读则基于对患者抗体结合的特定细胞特征的识别。

 由于IIF模式解释是基于视觉的,因此报告的标准化一直是一个难题。自身抗体标准化委员会下属的国际ANA模式共识组(ICAP)一直致力于促进对模式报告的讨论,并就特定ANA模式的相关形态学特征形成共识。

ICAP还就实验室应如何报告ANA模式提出了建议。该小组将六种细胞核模式作为定义为“基本能力水平”描述:均质型、斑点型、致密细斑点(DFS)型、着丝粒、散在核点型和核仁型。

ICAP建议,任何通过IIF方法进行ANA的实验室都应该能够准确和重现地识别这些模式。其余所谓“复杂”的细胞核模式可定义为“专家级”模式,可能只有在IIF分析方面具有特殊专长的个人才能识别。


 二、有关ANA的临床灵敏度和特异度 

在考虑实施哪种ANA测试时,了解每种方法的临床灵敏度和特异度是至关重要的。

许多研究比较了不同方法的临床灵敏度和特异度。由于IIF、EIA和MIA报告的结果如此不同,这些研究主要集中在定性一致上。

虽然看起来很简单,但不同类型比较起来确实困难,这主要是因为预期的灵敏度和特异度以及方法之间一致性在很大程度上依赖于设定的cut off值的不同。

从历史上看,IIF一直被认为是识别AARDs患者最敏感的方法。2009年美国风湿病学会关于ANA测试的立场声明,IIF法进行ANA测定为金标准方法,对SLE诊断灵敏度高(>95%)。同时也承认IIF特异度会因方法学受到到一定限制。

在一项行ANA常规测试的队列研究中证实,当将IIF的滴度cut off值定为1:40时,诊断灵敏度为94%,灵敏度均高于EIA和MIA法的74%和67%。

但IIFs较高的灵敏度是以牺牲特异度为代价的,在cut off值在1:40时,特异度仅为43%。相比之下,相应的EIA和MIA的特异度分别为80%和87%。

当我们将IIF滴度cutoff值提高到1:80时,特异度提高到了62%,但灵敏度下降到了84%。

研究数据表明,ANA的滴度可能有助于区分患者是否为AARDs。

2011年由Mariz等人进行的研究表明, 45.8%的健康对照人群ANA滴度可达1:80,而88.5%的ANA阳性AARD患者滴度大于等于1:320。

许多实验室在采用IIF测定ANA时,将筛选滴度定于远高于1:40稀释,可以有效提高特异度,但灵敏度一定损失。当实验室采用较高滴度进行筛选时,IIFs的灵敏度与EIAs和MIAs相当。

虽然IIFs具有使灵敏度最大化的能力,但是从实际的角度来看,EIA和MIA能更好地在灵敏度和特异度之间取得更好的平衡。

IIF的灵敏度与其采用具有广泛的抗原性相关。因为这种方法可以检测细胞中存在的数百种核抗原和细胞质抗原的抗体。

然而,并不是所有的抗原特异度都与AARDs的诊断相关。例如,DFS模式几乎只出现在没有AARD证据的患者中。有研究表明,DFS模式的存在可以用来排除ANA阳性个体是否为AARD。与此模式相关的抗原特异度已被确定为晶状体上皮衍生生长因子,也称为DFS70。

进一步的研究证实,DFS模式下DFS70的单特异度与AARD不一致,也就是说DFS70与疾病无关,或是说为阴性标志物。这种模式,以及其他类似的尚未被描述的模式,可能有助于解决由IIF进行的ANA测试所带来的一些特异度问题。


 三、对ANA方法的性能考虑 

如果实验室正在考虑采用何种方法进行ANA检测更佳时,首先要考虑的恐怕是否有合格的技师能胜任这个工作。这也是重点和首要考虑的问题。其次要考虑标本量、流程和自动化等问题。

虽然免疫学检测的自动化还没有达到生化检测的水平,但在过去十年中已经取得了重大进展,特别是采用EIA和MIA方面。

EIA可以手动执行,也能在实验室实现半自动或自动化测试。半自动化要稀释患者的样本并加试剂到平板,也需要技术人员移动到清洗平台上并将平板移至吸光度阅读器。而完全自动化的系统只需要技术人员加载样本和试剂。

大多数MIA系统是完全自动化的。多数MIAs法具有随机选择的优势,非常便于调整工作流程。而EIA法需要成批的标本。对于ANA申请量小的实验室,可能会影响工作流程和标本周转时间,从而产生不良影响。

MIA系统的另一个优点是,它能为实验室提供按需要扩展测试菜单的机会。大多数MIA系统不局限于做ANA检测,还可以有针对其他自身免疫性疾病(乳糜泻、抗磷脂综合征和血管炎)和传染病(EB病毒、HIV和单纯疱疹病毒)的试剂可用。能够增加项目并最大限度地利用仪器使MIA系统成为近期的热门。

从传统上讲,ANA检测一直采用的IIF方法,需要更多的富有经验的专业技术人员和相关的专业知识来完成。

IIF的自动化改进仅仅是自动稀释患者样本,并将标本和试剂加到玻片上。阅片则是纯手工过程,特别复杂模式需要经验丰富的专业技术人员解读。

现在已经有了从玻片处理到阅读的自动化设备,包括从样品和试剂的导入,还包括孵育和洗涤全过程。经过处理后,这些玻片就可以转移到一个带有高分辨率数码相机的封闭式显微镜中,这样就省去了暗室的需要。

这些新型的IIF系统中所采用的摄像机,可以从玻片的不同区域捕捉到多张数字图像。通过测量染色剂的荧光强度,当认为超过一定cut off值时则报告阳性。

对于确定为阳性的样本,计算机通过算法读取模式,并和已知ANA模式数据库荧光强度进行比较,从而给出结果。

虽然自动化步骤取代了以前人工阅片的过程,但最终的定性和模式解释仍然需要技术专家的专业知识。

对于每个样本,专业技术人员都必须确认计算机生成的结果。如果机器的结果与专家结果不符合,就需要改变报告结果。大多数自动化阅读能识别常见的ANA模式,也有可以识别混合模式的阅读器。

对于计算机无法识别的复杂模式,仍然需要专业技术人员做出解释。一些自动化阅读器不仅具有部分的自动模式解读功能,而且还可以估计滴度。这些仪器利用图像的荧光强度来估计样品的滴度,无需依靠连续稀释来判断。

这可以通过对单一患者的稀释或少数稀释来实现。最终依靠专业技术人员对模式的判断,来决定是否再采用连续稀释的效价来评估滴度。

选择自动化确实可以节省人工成本,增大标本量运行,但具体选择何种方法,还要根据实际情况。

过去的10年,ANA检测已经取得了长足进步,特别在自动化方面的改进,为自身免疫抗体检测的再造提供了良好的工具,为临床实验室多了许多选择。

但在做出究竟采用EIA、MIA还是IIF用于ANA检测时绝非简单选择。即使是现有指南推荐IIF用于ANA检测,也要知道没有一种方法是放之四海而皆准的。因此每个实验室都必须对哪种方法更适合患者和8ppav_www.8ppav.com人员做出最有益的评估。

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(责任编辑:lgh)

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